产品货号：
BTN60906
中文名称：
cDNA第一链合成试剂盒
英文名称：
Reverse Transcription Kit
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒提供cDNA第一链合成（逆转录）所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）以RNA为模板，高效合成cDNA。
- 使用突变的反转录酶，内源RNase H活性低，使得在逆转录过程中RNA模板不容易被降解，得到的cDNA平均长度更长。
- 最长可合成13kb的cDNA。
- 可以使用oligo-dT、随机引物和RNA专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提供）。
- 总RNA、poly(A)+RNA或特殊RNA均可作为模板。
- 得到的cDNA可用于后续的cDNA文库构建、RT-PCR、探针标记等。
| 组分 | 规格 |
| MMLV(含RI) | 50μL |
| 4×RT Buffer(含dNTP) | 250μL |
| Oligo (dT)12-18引物干粉 | 25μg |
| 6碱基随机引物干粉 | 10μg |
| 超纯水 | 1mL |
保存：-20℃，有效期1年。
本试剂盒足够50次20μL体系的逆转录反应。
- 在Oligo (dT)12-18引物干粉管中加入50μL超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.5μg/μL的Oligo (dT)12-18引物溶液；
- 在6碱基随机引物干粉干粉管中加入50μL超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.2μg/μL的随机引物溶液。没有用完的引物需要放置在-20℃保存。
一、合成PCR用的1st-strand cDNA
- 在一干净的反应管中加入RNA模板。
- RNA模板不能含有基因组DNA污染。
模板种类 加入量 总RNA 100～500ng poly(A) mRNA 10～500ng 专一的RNA 0.01pg～500ng - 加入引物和水
引物种类 加入量 Oligo (dT)12-18(0.5μg/μL) 1μL 6碱基随机引物(0.2μg/μL) 1μL RNA模板专一性引物 15-20pmol - 随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
- 加水到13μL。
- 70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
- 再加入5μL 4×RT Buffer(含dNTP)。
- 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成25℃ 5分钟以便其跟RNA结合。
- 加入1μL MMLV逆转录酶(含RI)，反应终体积为20μL。
- 42℃保温60分钟。但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，待合成了一段cDNA后，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
- 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。
二、合成建文库用的1st-strand cDNA
- 在一干净的反应管中加入RNA模板。
- RNA模板不能含有基因组DNA污染。
模板种类 加入量 poly(A) mRNA 1μg 专一的RNA 0.5～1μg - 加入引物
引物种类 加入量 Oligo (dT)12-18(0.5μg/μL) 1μL 6碱基随机引物(0.2μg/μL) 1μL RNA模板专一性引物 100pmol - 随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
- 加水到13μL。
- 70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
- 再加入5μL 4×RT Buffer(含dNTP)。
- 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5分钟。
- 加入2μL MMLV逆转录酶(含RI)，反应终体积为20μL。
- 42℃保温60分钟，但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
- 70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA的合成或放置在-20℃长期保存。
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